最初的523任務中，有嘗試中草藥和針灸抗瘧功效的研究小組，卻沒有中醫科學院的參與。直到1969年，為了「加強中草藥方面的研究力量」，中醫科學院應召加入，屠呦呦也隨之參與了項目。當時她38歲，職稱是助理研究員。
抓住青蒿素的關鍵——溫度
因為具有中西醫背景，而且勤奮，在那個資深科學家大部分已被打為右派的年代，屠呦呦很快被任命為研究組組長，帶領一個小組的成員開始查閱中醫藥典籍，走訪老中醫，埋頭於那些變黃、發脆的故紙堆中，尋找抗瘧藥物的線索。
耗時三個月，從2,000多個方藥中篩出640個，又鎖定到100多個樣本，最終入選的胡椒「雖對瘧原蟲抑制率達84%，但對瘧原蟲抑殺作用並不理想」。青蒿是當時的191號樣本，雖然曾經有過68%的抑菌率，復篩結果卻一直不好。
很長一段時間，這種不起眼的菊科植物都不是最受關注的藥物，直到有一天，屠呦呦決定：用沸點只有35℃的乙醚代替水或酒精來提取青蒿。這抓住了問題的關鍵——溫度正是青蒿素提取的關鍵。
青蒿、黃蒿、青蒿素
在各種傳說中，這個場景往往描述為：在某一天的凌晨或者深夜，閱讀葛洪的《肘後備急方》時，屠呦呦被靈感擊中——那本古方上說：「青蒿一握，以水兩升漬，絞取汁，盡服之。」然而，真實的實驗卻是繁複而冗雜的。
閱讀過屠呦呦部分實驗記錄的美國國家衛生研究院瘧疾研究室研究員蘇新專認為，「她的實驗設計還是非常嚴謹的。」在2009年出版的專著中，屠提到了當時的一系列實驗，「青蒿成株葉制成水煎浸膏，95%乙醇浸膏，揮發油無效。乙醇冷浸，控制溫度低於60℃，鼠瘧效價提高，溫度過高則無效。乙醚回流或冷浸所得提取物，鼠瘧效價顯著增高且穩定。」
她還特別提示：分離得到的青蒿素單體，雖經加水煮沸半小時，其抗瘧藥效穩定不變，「可知只是在粗提取時，當生藥中某些物質共存時，溫度升高才會破壞青蒿素的抗瘧作用」。
在那個特殊時期，不需要個人署名的論文，新的發現迅速變成了集體的財富。1972年3月8日，在南京一次會議上，以「毛澤東思想指導發掘抗瘧中草藥」為題，屠呦呦彙報了自己在青蒿上的發現。很快，雲南和山東等數個研究小組借鑒了她的方法，對青蒿進行研究。
自己的發現公布後不久，從黑色膠狀的青蒿乙醚提取物中，屠的研究小組獲得了他們起名為「青蒿素Ⅱ」的白色的針狀結晶。這種結晶在臨床前的動物毒性實驗中表現出了對實驗動物明顯的心髒毒性。是否執行原方針，盡快拿到現場進行臨床試用觀察？屠呦呦和她的「單位」選擇了富有當時特色的解決方式——先由三位科技人員進行「探路試服」，「由屠呦呦帶頭共三人，經領導審批，住進中醫學院附屬東直門醫院⋯⋯」
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